DNA Methylation 분석에서 Control의 역할

“신뢰성과 재현성 향상”

Methylation 분석을 위한 Controls : 어떻게, 언제, 왜 사용해야할까요?

모든 과학적 실험에는 대조군이 필요합니다. 특히 DNA 메틸화 분석과 같은 특정 유형의 실험에는 특수한 대조군이 요구됩니다.

DNA 메틸화는 강력하고 잘 연구된 epigenetic 표지로 전사 조절, 배아 발달, 유전체 안정성, 그리고 염색질 구조에 대한 깊은 통찰을 지속적으로 제공하고 있습니다. 또한 DNA 메틸화 프로필의 변화는 많은 질병의 발생과 연관되어 있습니다.

임상 응용 분야에서는 DNA 메틸화를 조기 발견, 진단, 개인 맞춤 치료를 위한 바이오마커로 널리 활용하고 있습니다. 이를 위해서는 특정 영역이나 단일 염기 수준에서의 메틸화 패턴을 정확하게 특성화하는 것이 필요합니다.

가장 일반적으로 사용되는 DNA 메틸화 분석법에는 

NGS를 이용한 bisulfite sequencing, methylation-specific PCR (MSP), methylation-sensitive restriction enzyme (MSRE) assays 등이 있습니다.

임상 응용에서 특히 중요한 것은 메틸화 수준을 정량화할 때의 편향(bias)을 최소화하는 것입니다. 이를 위해서는 각 분석법을 신중히 설계하고 최적화하여 재현성과 안정성을 확보해야 합니다. 이 과정에서 확립된 대조군(controls)을 도입하는 것이 분석법 최적화 및 효율성 모니터링의 핵심입니다.

DNA 메틸화 분석을 최적화하기 위해서는, 이미 메틸화 정도가 알려진 DNA 표준물질(standards)을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 일반적으로, 모든 CpG 위치에서 각각 거의 100% 메틸화된 DNA standard와 0% 메틸화된 DNA standard가 필요합니다.

이 두 가지 DNA standard을 개별적으로 또는 조합하여 사용하는 것은 분석법 개발 과정에서 발생할 수 있는 잠재적 편향을 파악하는 데 도움을 줍니다. 또한, 확립된 워크플로우에서는 이들 DNA standard 가 양성 대조군(positive control)과 음성 대조군(negative control)으로 작용하여 실험 절차와 결과를 검증하는 데 활용됩니다. 이는 임상 검사에서 품질 관리와 보증을 강화하는 데 필수적입니다.

DNA 메틸화 분석 워크플로우 검증을 위한 품질 관리

일반적으로 좋은 실험 관행으로, 메틸화된 DNA standard와 비메틸화된 DNA standard를 실험 샘플과 병행하여 처리하는 것이 전체 워크플로우의 품질 관리에 도움이 됩니다. standard은 매번 일관된 결과를 내는 것이 기대되는 반면, 실험 샘플은 많은 변수를 가질 수 있어 문제 해결이 어려울 수 있습니다. PCR 및 NGS 기반 DNA 메틸화 분석에서는 샘플에서 유래한 억제물질, 프라이머 설계, 효소 시약, 장비 오류, 그 외 여러 요인들이 분석 실패의 원인이 될 수 있습니다. 이때 standard에서 생성된 데이터는 문제 해결을 어디서부터 시작해야 하는지를 알려줄 수 있습니다. 예를 들어, standard는 예상대로 작동했지만 실험 샘플의 성능이 저조하다면, 워크플로우 자체는 정상적으로 작동하는 것이며, 이는 실험 샘플의 품질 문제가 원인일 수 있음을 시사합니다. 반대로, standard가 기대한 대로 작동하지 않았다면, 워크플로우 내부에 문제가 있어 분석이 실패했음을 의미할 수 있습니다.

Bisulfite 기반 분석의 최적화 및 교정을 위한 Controls 

Bisulfite PCR (BSP)는 단일 염기 해상도(single-base resolution)에서 메틸화 분석을 위해 널리 사용되는 방법입니다. 시료는 먼저 bisulfite conversion를 거친 후, bisulfite 특이적 프라이머를 사용하여 증폭됩니다. 생성된 PCR 산물은 NGS, Sanger sequencing, pyrosequencing 등을 통해 분석되어 각 시토신(cytosine)의 메틸화 상태를 판별합니다 .그러나 BSP용 프라이머 쌍은 반드시 메틸화된 서열과 비메틸화된 서열을 동일한 효율로 증폭해야 합니다(Figure 1). 그렇지 않으면, 증폭 과정에서 발생하는 편향이 메틸화 수준을 왜곡된 결과로 이끌 수 있습니다.

Figure 1. Bisulfite PCR 프라이머는 메틸화된, 비메틸화된, 또는 부분적으로 메틸화된 주형을 동일한 효율로 증폭해야 합니다.
Bisulfite 처리된 비메틸화 DNA와 메틸화 DNA contro을 동일한 양으로 준비하여, 실험 샘플과 병행하여 MGMT를 타겟으로 설계된 프라이머를 사용해 증폭하였습니다.
비메틸화 및 메틸화 주형에서 관찰된 밴드의 세기가 동일하게 나타났으며, 이는 해당 프라이머 쌍이 편향되지 않았음(unbiased)을 보여줍니다.

메틸화 및 비메틸화 DNA Control을 사용하면 BSP 프라이머를 다음 기준에 따라 쉽게 최적화 (검증)할 수 있습니다:

Bisulfite PCR과 달리, methylation-specific PCR (MSP)은 메틸화 및 비메틸화 주형을 서로 다른 두 프라이머 세트로 차별적으로 증폭해야 합니다. 하나는 메틸화 특이적 프라이머 세트로, 증폭이 일어나면 해당 영역이 완전히 메틸화되었음을 의미합니다. 다른 하나는 비메틸화 특이적 프라이머 세트로, 증폭이 일어나면 해당 영역이 완전히 비메틸화되었음을 의미합니다. 만약 두 프라이머 세트 모두에서 산물이 생성된다면, 해당 영역은 부분적으로 메틸화된 것입니다. 이러한 MSP에 필요한 두 가지 프라이머 세트 역시, 메틸화 및 비메틸화 DNA Control 을 활용하여 다음 기준에 따라 최적화 및 검증할 수 있습니다.

프라이머 검증 과정에서, 이미 특성이 규명된 메틸화 및 비메틸화 DNA standard을 사용하면 절차를 간소화할 수 있습니다. 예를 들어, 비메틸화 프라이머로 메틸화 DNA standard을 증폭했을 때 혹은 그 반대의 경우에 미약한 PCR 신호가 관찰된다면, 이는 해당 프라이머 세트가 비특이적임을 의미합니다. 확립된 워크플로우, 특히 임상 분석에서 메틸화 및 비메틸화 DNA standard은 양성 대조군(positive control)과 음성 대조군(negative control)으로 사용되어 MSP 워크플로우를 검증할 수 있습니다. 이러한 standard은 Bisulfite 처리, 증폭, 분석 등 전체 과정이 잘 작동하고 있음을 확인하며, 시험 샘플의 결과가 신뢰할 만함을 보장합니다(Figure 2).

Figure 2. 메틸화 및 비메틸화 control은 MSP 분석의 민감도 검증에 중요합니다. 메틸화 control은 메틸화 프라이머에 의해서만, 비메틸화 control은 비메틸화 프라이머에 의해서만 증폭됩니다. sample1은 두 프라이머 세트 모두에 의해 증폭되었으며, 이는 혼합 메틸화(mixed methylation)가 존재함을 의미합니다.

*샘플들은 Agilent D100 ScreenTape에서 분석되었습니다.

프라이머 검증 외에도, DNA standard은 귀중한 샘플을 대체하여 새로운 프라이머 세트의 annealing온도를 최적화하는 데 사용할 수 있습니다(Figure 3).
새로 설계된 각 프라이머 세트에 대해서는 의도한 타겟을 최적으로 증폭할 수 있도록 annealing 온도 구배 실험을 수행해야 합니다.

프라이머 설계에 대한 더 많은 팁은 Bisulfite Beginner Guide를 참고하시기 바랍니다.

Figure 3. MGMT를 타겟으로 하는 프라이머 세트는 58 °C에서 64 °C까지의 annealing 온도 범위에서 반복된 PCR 반응을 통해 최적화되었습니다.

Methylation Sensitive Restriction Enzyme(MSRE) 분석을 위한 Controls

Methylation sensitive restriction enzyme(MSRE) 분석은 제한효소가 메틸화된 cytosine과 비메틸화된 cytosine을 구별할 수 있다는 원리에 기반합니다. 제한효소 인식 부위가 메틸화되어 있지 않으면 효소가 DNA를 절단하지만, 메틸화된 부위는 절단되지 않습니다. 그 후 절단된 샘플과 절단되지 않은 샘플의 증폭 정도를 qPCR로 비교하여 해당 부위의 메틸화 상태를 평가할 수 있습니다. 두 샘플 간의 ΔC(t) 값이 작을수록 메틸화 수준이 높음을 의미하며, ΔC(t)가 클수록 메틸화 수준이 낮음을 의미합니다(Figure 4).

또한, 아가로스 겔 전기영동과 같은 DNA 시각화 방법을 사용하여 관심 부위에서 절단이 발생했는지 여부를 확인할 수도 있습니다. 메틸화 및 비메틸화 DNA standard은 실험 샘플과 병행하여 digestion해야 제한효소가 메틸화된 부위와 비메틸화된 부위를 구별하는 강건성을 입증할 수 있습니다. 이는 또한 관심 부위에서 해당 분석법의 민감도를 평가하는 데 도움을 줍니다.

Figure 4. 증폭 커브는 절단된 샘플과 절단되지 않은 샘플 간의 Ct 값 차이를 보여줍니다. MSRE 분석에서 메틸화 DNA control은 100.9%, 비메틸화 DNA 대조군은 **2.7%**의 메틸화 수준으로 검출되어, 분석이 효율적으로 작동했음을 확인했습니다. 시험 샘플의 메틸화 수준은 **17.3%**로 결정되었습니다.

기타 응용실험를 위한 DNA Standards

DNA standard은 이미 메틸화 패턴이 알려진 고품질 게놈 DNA이므로, 다양한 응용 실험을 최적화하는 데 활용될 수 있습니다. 따라서 귀중한 DNA 샘플이나 문제가 많은 샘플을 사용하는 대신, 실험 조건을 조정할 때 이상적인 대체재로 쓰일 수 있습니다. 예를 들어, FFPE DNA의 bisulfite library preparation를 최적화할 때, DNA standard은 손쉽게 초음파 분쇄(sonication)나 절편(fragmentation) 과정을 거쳐 실제 실험 샘플과 유사하게 만들 수 있습니다.

메틸화 및 비메틸화 DNA standard은 이미 여러 메틸화 분석에서 control으로 활용되고 있습니다:

• MethyLight assays5, 6

• Methylation-sensitive high-resolution melt analysis7-9

• Pyrosequencing10, 11

• Methylation arrays12

• Methylated DNA Immunoprecipitation13

• Bisulfite sequencing library preparation14

대표적인 예로, Human Methylated & Non-methylated DNA Standards는 인간 샘플의 메틸화 분석을 위한 검증된 control 세트이며, 위에 언급된 모든 분석법뿐만 아니라 그 외 다양한 연구에서 널리 사용되고 있습니다. 또한, Zymo Research는 데이터의 품질을 보장하고 출판 준비가 된 결과를 확보할 수 있도록, 기타 분석법의 최적화나 품질 관리를 위해 사용할 수 있는 다양한 DNA Standards도 제공합니다.

DNA Methylation Standards Product Guide

References

14.Zheleznyakova, G. Y.; Nilsson, E. K.; Kiselev, A. V.; Maretina, M. A.; Tishchenko, L. I.; Fredriksson, R.; Baranov, V. S.; Schiöth, H. B., Methylation levels of SLC23A2 and NCOR2 genes correlate with spinal muscular atrophy severity. PLoS One 2015, 10 (3), e0121964.